NK-клетки или естественные киллеры. Морфологически сходны с лимфоцитами. Близки к ним по происхождению. Однако крупнее их и содержат множество цитоплазматических вакуолей. Обладают цитотоксической функцией. Распознают чужеродные или измененные собственные клетки с помощью механизма, отличающегося от механизма, используемого Т-лимфоцитами.

NK-клетки — большие зернистые лимфоциты с характерной морфологией: основная часть обильной цитоплазмы содержит несколько митохондрий, свободные рибосомы с отдельными элементами шероховатого эндоплазматического ретикулума, аппарат Гольджи и характерные электроноплотные гранулы, связанные с мембраной. Большие зернистые лимфоциты с активностью нормальных киллеров выполняют цитотоксические функции, также как и цитотоксические T- лимфоциты.

Основное назначение НК-клеток — уничтожение повреждённых или инфицированных клеток организма (они убивают опухолевые и заражённые вирусами клетки).

Активные НК-клетки появляются уже через двое суток после заражения хозяина вирусом. Низкая активность НК-клеток несёт в себе повышенный риск развития таких заболеваний, как рак.

Численность нормальных киллеров (NК-клеток) в организме человека (лимфоциты периферической крови) – около 5%. Для NК характерны неперестроенное (гаметное) расположение генов с фенотипом CD3-CD16+CD56+CD94+ . Как видим, нормальные киллеры не имеют маркеров В- и Т-лимфоцитов, хотя и являются лимфоидным клетками.

Предполагается, что нормальные киллеры способны узнавать структуры высокомолекулярного гликопротеина, экспрессирующегося на мембранах зараженных вирусами клеток. Сближение с клеткой-мишенью и ее распознавание возможно благодаря рецепторам NK. Происходит активизация нормальных киллеров, при которой в пространство вне клеток выбрасывается содержимое гранул.

Считается, что главенствующая роль в данном процессе принадлежит цитолизину (перфорину), обладающему некоторым структурным сходством с элементом комплимента С9 (антителами к перфорину подавляется уничтожение вне клетки). Встраиваясь в мембраны клеток-мишеней, перфорин формирует трансмембранные поры, следствием чего является гибель клеток, поскольку их содержимое через эти поры вытекает. К тому же в гранулах нормальных киллеров присутствует две разновидности сериновой протеинкиназы, способной исполнять роль цитолитических факторов, однако ее влияние на NK-зависимый лизис до конца не изучена. Также в NK обнаружено присутствие устойчивого к протеинкиназам хондроитинсульфата А-протеогликана, способного защитить клетку от автолизиса. Установлено, что, распознавая мишени, NK-клетка производит распознавание, как «положительное», так и «отрицательное».

Эти клетки, как и В-клетки, образуются в красном костном мозгу.

а) На поверхности NK-клеток нет Ig-подобных рецепторов. Тем не менее с помощью рецепторов другой природы NK-клетки настроены на узнавание определенных белков на поверхности нормальных клеток.

б) Активация NK-клеток происходит тогда, когда указанные белки изменены. Наиболее часто такая ситуация возникает в случае опухолевых клеток и клеток, зараженных вирусом.
Поэтому считают, что NK-клетки – важнейший элемент противоопухолевого иммунитета, и в этом отношении их значение даже больше, чем Т-лимфоцитов.

в) Кроме того, NK-клетки имеют рецепторы к Fс-области IgG. Благодаря им NK-клетки (подобно нейтрофилам и макрофагам) атакуют и те клетки, с поверхностью которых связались антитела.

г) В гранулах NK-клеток содержится белок перфорин и протеолитические ферменты гранзимы. С их помощью и осуществляется разрушение клетки-мишени.

NK-клетки обладают рецепторами подавления цитотоксичности (от англ: killer inhibitory receptor – KIR), что отличает их от Т-киллеров. В случаях отрицательного распознавания данные рецепторы взаимодействуют на клетке-мишени с молекулой МНС класса I, вследствие чего инфицированная клетка получает сигнал к торможению цитотоксической активности. К положительному распознаванию приводит отсутствие на клетках-мишенях экспрессии молекул MHC, а также взаимодействие инфицированных клеток с NK-клетками при участии особых рецепторов NK-клетки, таких как CD69 и CD2, либо антител, связанных с ними посредством рецептора для Fc – CD16.

Процесс связывания нормальных киллеров со сформировавшими на поверхностях клеток-мишеней иммунные комплексы+антигены антителами, интерпретируют как проявления клеточной активности киллеров, другими словами, как антителозависимую клеточную цитотоксичность. Например, вирус герпеса пытается избежать распознавания Т-киллером, прибегая к подавлению экспрессии молекулы МНС класса I на поверхности зараженной клетки. В подобных случаях вирус распознает NK-клетка.

Точная природа происхождения нормальных киллеров не выяснена до сегодняшнего дня. Их генезис принято связывать с БГЛ – большими гранулярными лимфоцитами. Хотя NK и напоминает морфологически лимфобласты или лимфоциты, однако их гистогенетические связи с В- или Т-лимфоцитами не определены. Характерной особенностью нормальных киллеров является присутствие Fc-рецепторов.

Дефицит перфориновой дегрануляции NK-клеток приводит к развитию тяжелого синдрома семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, выявляемого приблизительно в одном из 50 000 случаев.

Видео: Immune System — Natural Killer Cell


Основные статьи: Иммунный ответ, Естественные киллеры

Механизмы цитотоксичности

Спонтанная клеточно-опосредованная цитотоксичность обеспечивается естественными киллерами (ЕК).

Что такое NK клетки

Они содержат поверхностные киллинг-активирующие рецепторы, относящиеся к классу лек-тинов. В связи с этим ЕК распознают остатки мембранных углеводов на клет-ках-мишенях. Поскольку подобные молекулы являются «вездесущими», ЕК готовы проявить цитотоксичность практически к любой клетке организма. Для предупреждения аутоагрессии естественные киллеры снабжены киллинг-ингибирующими рецепторами, которые распознают молекулы HLA I, причем только те разновидности, которые свойственны данному организму.

Актива-ция киллинг-ингибирующих рецепторов приводит к отмене цитотоксическо-го эффекта. Таким образом, ЕК разрушает клетку в случае нарушенной экс-прессии молекул гистосовместимости I класса.

Такие изменения часто проис-ходят в вирус-инфицированных или опухолевых клетках для предотвращения атаки со стороны Т-киллеров, которые рестриктированы по HLA I. В этом случае в работу вступают ЕК и разрушают измененные клетки.

Некроз

Собственно эффекторный механизм состоит в высвобождении мономеров перфорина, которые полимеризуются в мембране клетки-мишени в присутст-вии ионов Са2+, образуя тем самым стабильный трансмембранный канал.

Ци-топлазма любой клетки является гиперосмолярной по сравнению с тканевой жидкостью, поэтому внеклеточная вода устремляется через перфориновые от-верстия внутрь клетки, что приводит к прогрессирующему нарастанию внут-риклеточного давления и последующему разрыву клетки.

Этот механизм на-зывается осмотическим лизисом и по природе своей является некрозом. Следует отметить, что осмотический лизис не самый приемлемый для организма спо-соб уничтожения измененных клеток. Дело в том, что фрагменты погибших клеток вызывают развитие асептического воспаления, которое при массив-ном цитолизе приводит к гипертермии и появлению признаков интоксикации. С другой стороны, клетки-мишени активно сопротивляются осмотическому лизису. Так, ими осуществляется эндоцитоз тех участков мембраны, в которых вмонтированы перфориновые каналы.

За счет этого происходит восстановле-ние целостности фосфолипидного бислоя цитолеммы и нивелируется перфориновый механизм повреждения.

Апоптоз

см. Апоптоз Материал с сайта http://wiki-med.com

Поэтому естественные киллеры располагают другим эффекторным механиз-мом, который реализуется параллельно с осмотическим лизисом.

Он состоит в том, что через образованные поры вводят специальные ферменты — гранзи-мы, активирующие цитоплазматический каспазный каскад, что приводит к де-струкции ДНК латентными эндонуклеазами.

Если клетка-мишень совершает эндоцитоз фрагментов мембраны с порами, этим она только усугубляет свое положение, поскольку обеспечивает транспорт гранзимов вглубь цитоплаз-мы, где содержатся каспазы. По природе своей этот механизм гибели является апоптозом и реализуется за счет ресурсов самой скомпрометированной клетки. Когда такая клетка погибнет, причинный естественный киллер может оказаться уже в другом месте, проявляя цитотоксический эффект по отно-шению к новой мишени.

В результате апоптотической гибели не развивается асептическое воспаление, так как образующиеся фрагменты клеток окружают-ся мембранами. Это бесспорное преимущество апоптотического киллинга. Не-достатком его является зависимость от свойств самой клетки-мишени, так как, выделяя гранзимы, ЕК «полагается» на сохранность системы апоптоза в ней.

Известно, что зачастую злокачественная трансформация как раз и происходит в результате сбоев в программе самоликвидации клетки. Таким образом, каж-дый из механизмов (апоптоз и некроз) имеет свои недостатки, но их сочетание значительно повышает эффективность киллинга.

• катехоламины и естественные киллеры

• механизм миграции лейкоцитов

• т-клеточная цитотоксичность

• механизмы клеточной цитотоксичности

• клеточная токсичность

Т-лимфоциты (CD3+ клетки). В более редких случаях NK-клетки понижены. Установлено, что, распознавая мишени, NK-клетка производит распознавание, как «положительное», так и «отрицательное». Вдобавок через эти отверстия в клетку входят другие ферменты натуральных киллеров – протеазы.

Они представляют собой разновидность иммунокомпетентных клеток, а их функция понятна из названия. Она заключается в том, чтобы уничтожать «врагов», угрожающих нашему здоровью, а именно разрушать клетки, зараженные вирусом и пораженные онкологическим процессом.

Как известно, другая разновидность лимфоцитов – Т-клетки – обладает способностью уничтожать точно те же объекты, за которым «охотятся» натуральные киллеры.

В результате Т-клетки не распознают вредные частицы как угрозу, и агрессоры остаются для них невидимыми. В отличие от Т-лимфоцитов, натуральные киллеры все равно вычисляют и немедленно уничтожают «замаскированных» агрессоров.

Откуда берутся и как выглядят NK-клетки?

При этом нарушении вследствие дефекта определенных генов возникает резкое повышение активности клеток иммунитета, включая натуральные киллеры. Последнее наглядно показывает, что изменение функции и числа NK-клеток может иметь самые разрушительные последствия.

Это средство создано на основе цитокинов – информационных молекул, которые содержат сведения о том, как разным иммунным клеткам надо правильно осуществлять работу.

Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.

Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться. Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации.

Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток.

Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.

Распознают чужеродные или измененные собственные клетки с помощью механизма, отличающегося от механизма, используемого Т-лимфоцитами.

Большие зернистые лимфоциты с активностью нормальных киллеров выполняют цитотоксические функции, также как и цитотоксические T- лимфоциты.

Предполагается, что нормальные киллеры способны узнавать структуры высокомолекулярного гликопротеина, экспрессирующегося на мембранах зараженных вирусами клеток. Сближение с клеткой-мишенью и ее распознавание возможно благодаря рецепторам NK.

Происходит активизация нормальных киллеров, при которой в пространство вне клеток выбрасывается содержимое гранул.

Также в NK обнаружено присутствие устойчивого к протеинкиназам хондроитинсульфата А-протеогликана, способного защитить клетку от автолизиса.

Лимфоциты в крови: повышены, понижены, в норме

Тем не менее с помощью рецепторов другой природы NK-клетки настроены на узнавание определенных белков на поверхности нормальных клеток.

Наиболее часто такая ситуация возникает в случае опухолевых клеток и клеток, зараженных вирусом

Естественные киллеры относят к гранулярным лимфоцитам: они содержат гранулы, внутри которых находятся выработанные эндоплазматической сетью ферменты.

Перфорин действует на мембрану клетки, разрушая ее: в мембране формируются отверстия, через которые внутрь клетки проникает вода, а органеллы выходят в околоклеточное пространство.

Снижение или увеличение количества естественных киллеров вполне возможно.

В основном это встречается в тех случаях, когда иммунитету есть, от чего защищать организм.

Вскоре клетка теряет способность функционировать и погибает.

Один из таких ферментов (перфорин) выделяется в момент контакта натурального киллера с атакуемой клеткой. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Дело в том, что NK-клетки повышены и активизируются только в те моменты, когда иммунная система «понимает», что Т-лимфоциты с угрозой не справятся.

Основные статьи: Неспецифический клеточный иммунитет, Антителозависимая цитотоксичность, Защита кожи

Естественные киллеры — это большие гранулярные лимфоциты, низ-кодифференцированные потомки стволовой клетки.

На мембране естественных киллеров содержатся рецепторы к γ -интерферону, ИЛ-2 и ИЛ-12, поэтому указанные цитокины способны активировать естественные киллеры.

Также естественные киллеры содержат кластеры CD16 и CD56, по которым проводится лабораторная идентификация этих клеток.

Функции естественных киллеров

Иммунная толерантность

Различают тканевые и цир-кулирующие естественные киллеры. Тканевые естественные киллеры содержатся в печени и плаценте, обеспечивая поддержание иммунной толерантности к пищевым антигенам и антигенам плода соответственно.

Для этого указанные естественные киллеры связываются с активированными лимфоцитами и инициируют каскад апоптоза в них, т е. совершают киллинговый эффект.

Цитотоксичность

Клеточная цитотоксичность

Не ври - Не проси

Клеточная цитотоксичность

Циркулирующие естественные киллеры обеспечивают защиту от спонтанно измененных собственных клеток (в том числе — опухолевых), а также принимают участие в разрушении вирус-инфицированных клеток.

Реакция, в которой принимает участие естественный киллер, называется спонтанной клеточно-опосредованной цитотоксичностью (СКОЦ), поскольку для ее реализации не требуется антител и комплемента.

Механизм СКОЦ состоит в следующем (рис.

10). С помощью киллинг-активирующего рецептора естественные киллеры взаимодействуют с олигосахарами ганглиозидов и гликозаминогликанов поверхностных структур клеток-мише-ней. Поскольку такие молекулы являются «вездесущими», естественные кил-леры потенциально могут повреждать практически любую собственную клет-ку.

Естественно, этого в организме не происходит. Дело в том, что активацию естественного киллера предупреждает киллинг-ингибирующий рецептор, распоз-нающий молекулы HLA I класса (только те разновидности, которые присущи конкретному организму). Поэтому клетки-мишени отбираются по экспрессии специфических молекул HLA I — при отсутствии такой экспрессии или же «чужой» структуре молекул гистосовместимости запускается киллинговый ме-ханизм (так называемый поцелуй смерти).

Материал с сайта http://wiki-med.com

Приведенные данные указывают на то, что естественные киллеры активируются при наруше-нии баланса между триггерными рецепторами, реагирующими не только на микробные продукты, но и на структуры активно пролиферирующих собственных клеток, и ингибирующими рецепторами, реагирующими на HLA-мо-лекулы I класса («метки» своего).

Такое сочетание неспецифических триггер-ных и специфических ингибирующих рецепторов позволяет естественные киллеры эффективно реагировать на широкий круг мишеней — от чужеродных микробов, ксено-генных и аллогенных клеток до собственных патологически измененных или даже излишне активных клеток.

Антителозависимая цитотоксичность

Антителозависимая цитотоксичность

В то же время естественные киллеры способны вступать в реакции антителозависимой клеточно- опосредованной цитотоксичности, поскольку содержат поверхностные Fc-ре-цепторы.

Материал с сайта http://Wiki-Med.com

На этой странице материал по темам:

• tckb gjdsitys tcntcndtyyst rbkkths

• киллинговый механизм лимфоцита

• медицина-натуральные киллеры

• натуральные киллеры и канцерогенез

• отчего в рови снижены натуральные киллеры

Лимфоциты также отвечают за «иммунную память» организма. В отличие от других видов лейкоцитов, они сражаются больше не с внешними агентами, а с внутренними, например, с собственными пораженными клетками (мутирующими, раковыми, вирусными и т.д.).

Виды лимфоцитов и их функция

Попадая в кровь, лимфоциты проживают в «базовом» виде пару суток, затем железы организма распределяют их на различные функциональные подвиды, что позволяет лимфоцитам более точно реагировать на патогенные микроорганизмы.

Т-лимфоциты

Вилочковая железа (тимус) отвечает за создание Т-лимфоцитов из 80% базовых.

После «обучения» Т-лимфоциты, в свою очередь, распределяются на подвиды:

• Т-хелперы (помощники);
• Т-киллеры (убийцы);
• Т-супрессоры (ограничители).

Убийцы, естественно, обучены атаковать инородные агенты и устранять их.

Помощники вырабатывают специальные компоненты, которые поддерживают и улучшают функцию киллеров. Супрессоры буквально ограничивают ответ иммунитета на вторжение, чтобы предотвратить активное расщепление здоровых клеток собственного организма.

В-лимфоциты

Из базового набора до 15% белых клеток становятся В-лимфоцитами. Они считаются одними из самых важных клеток иммунитета. Им достаточно один раз встретится с чужеродным агентом (бактерия, гистамин, грибок, вирус и т.д.), чтобы навсегда запомнить и его, и способ борьбы с ним, что делает реакцию иммунитета в будущем более быстрой и точной.

NK-лимфоциты (CD16) в крови

Благодаря функции приспособления В-лимфоцитов появляется иммунная устойчивость на всю жизнь, а также повышается эффективность прививания.

NK-лимфоциты

Naturalkiller (NK) с английского переводится как «естественные (природные) убийцы», что максимально точно соответствует назначению этих агентов. Только 5% базовых лимфоцитов перерождаются в NK-лимфоциты. Этот подвид полностью отвечает за устранение собственных клеток, если в них образуются маркеры поражений вирусами или раком.

Показания к анализу

Анализ на лимфоциты проводят в рамках клинического (общего) исследования крови с лейкоцитарной формулой.

Назначают его при диагностике следующих патологий:

• общие воспалительные процессы в острой и хронической форме;
• аутоиммунные заболевания;
• инфекционные, вирусные или грибковые поражения;
• нагноение и сепсис;
• внутреннее кровотечение;
• онкология;
• аллергическая реакция;
• патологическое протекание беременности;
• заболевания кроветворной и кровеносной системы;
• патологии лимфатической системы;
• лучевая болезнь;
• контроль эффективности лечения.

Норма лимфоцитов

Белые клетки оценивают так же, как и лейкоциты, на основании абсолютного (LYM#) и относительного (LYM%) показателей.

В случае выявления аномальных значений назначаются дополнительные анализы, которые позволяют точно определить количество подвидов лимфоцитов.

Как правило, такая потребность возникает для оценки активности иммунного процесса, ответа и памяти.

Лимфоциты повышены (лимфоцитоз)

В результате анализа может быть выявлено превышение нормы лимфоцитов, положенной по возрасту и индивидуальным физиологическим показателям. Такое отклонение называется лимфоцитоз и свидетельствует о следующем:

• в организме присутствуют воспалительные или инфекционные процессы, вирусные, бактериальные патологии;
• в патогенезе заболевания наблюдается пик или переход на раннюю стадию выздоровления;
• наличие болезни, которая, как правило, встречается один раз в жизни и вырабатывает стойкий иммунитет (ветрянка, мононуклеоз, краснуха, корь и другие);
• отравление организма тяжелыми металлами (свинец), химическими компонентами (мышьяк, тетрахлорэтан), некоторыми медицинскими препаратами.

  Уровень лимфоцитов в этом случае позволит оценить величину и опасность принятой дозы;

• онкологические процессы.

Лимфоциты понижены (лимфопения)

Количество лимфоцитов может сокращаться в трех случаях:

Организм произвел выброс лимфоцитов для устранения инородного агента, белые клетки погибли, и анализ был произведен именно в этот момент (еще до созревания новых «защитников»).

Это могло произойти в процессе болезни на ранней стадии (до наступления пика). Иногда низкие лимфоциты дают и «продолжительные» патологии, такие как СПИД, ВИЧ и туберкулез.

Лечение некоторыми группами препаратов, например, кортикостероидами, цитостатиками и пр.

Были поражены органы и системы, ответственные за кроветворение и конкретно за образования лимфоцитов.

В этом случае причиной низкого уровня лимфоцитов могут стать:

• все виды анемии (железодефицитная, фолиеводефицитная, апластическая);
• болезни крови (лейкозы);
• лимфосаркома, лимфогранулематоз;
• раковые опухоли и методы их лечения (химио- и лучевая терапия);
• болезнь Иценко-Кушинга.

Низкий уровень лимфоцитов зачастую свидетельствует о серьезных и даже неизлечимых патологиях.

Расшифровку анализа проводит врач-гематолог, консультируясь с диагностом, инфекционистом и онкологом.

Чем раньше будет проведен анализ, тем больше вероятность определить заболевание на ранней стадии и обеспечить эффективное лечение пациента.

Подготовка к процедуре

Подготовка к анализу предполагает следующие действия:

• перед сдачей крови в течение 10-12 часов нельзя употреблять пищу. Поэтому анализ назначают на утреннее время (обычно до 12 часов), кроме случаев, когда уровень лимфоцитов необходимо контролировать регулярно.

  У грудничков процедуру проводят через 1,5-2 часа после кормления.

• воду можно пить только без газа, а за 1-2 часа до процедуры воздержаться и от нее. Соки, горячие напитки, газировка и т.д. запрещены.
• за 24 часа до процедуры необходимо исключить алкоголь, острую и тяжелую пищу, а за 2 часа отказаться от курения или использования никотинозаменителей.
• перед сдачей крови нужно сообщить врачу о приеме лекарств и прохождении физиотерапевтических или других лечебных курсов.

  Желательно делать анализ до или через 2 недели после лечения.

• рекомендуется сдавать анализ (в том числе повторный) в лаборатории той больницы, где будет проходить дальнейшее обследование и лечение.

Для стандартного микроскопического исследования берут капиллярную кровь из пальца или из вены.

У новорожденных забор крови может производиться из пятки.

Если в лаборатории применяются современные счетчики-цитометры, то для исследования необходимо не менее 5 мл материала. В этом случае забор крови осуществляется из вены.

Что может повлиять на результат

• Ошибка медсестры в процессе забора крови, а также нарушение правил хранения и транспортировки биоматериала;
• Ошибка лаборанта при изучении материала;
• Недобросовестность пациента, который нарушил правила подготовки к анализу;
• Любой, даже незначительный, стресс или физическая нагрузка непосредственно перед сдачей анализа;
• Медицинские манипуляции, проведенные накануне процедуры (рентгенография, физиотерапия, пункция, МРТ, КТ, массаж и т.д.);
• Резкое изменение положения тела перед сдачей крови также может дать ложноположительный результат;
• Менструации у женщин.

  Врачи советуют проводить анализ не раньше, чем на 4 день после окончания менструального кровотечения;

• Беременность. Пациентка должна предупредить врача перед забором крови о ранних сроках беременности.

Аннотация

NK-клетки характеризуются как не В-клетки и не Т-клетки, лишённые характеристик зрелых макрофагов, которые развиваются из клеток костного мозга независимо от влияния тимуса. NK-клетки играют решающую роль в гибели опухоли, иммунологическом надзоре, сопротивляемости инфекциям и иммунном регулировании процессов организма. Разрушение нормальными киллерами раковых клеток включает в себя определенную последовательность событий. Во-первых, клетка NK распознает раковую клетку и привязывается к ней. Этот процесс требует межрецепторного взаимодействия. NK-клетка выделяет гранулы, которые проникают в раковую клетку и в конечном итоге убивают ее. После чего NK-клетка освобождается для привязки к другой раковой клетке и процесс повторяется.

Однако раковые клетки знают, как вести своего рода клеточную войну. Мы впервые в нашей лаборатории открыли, что раковые клетки могут уничтожать лейкоциты посредством фагоцитоза. Мы наблюдали три способа, которыми это делается. Раковая клетка может окружить с двух сторон лейкоциты или может создать чашеобразное отверстие, внутрь которого затягиваются лейкоциты. Третий способ заключается в том, что раковая клетка вытягивает длинное плечо, чтобы захватить лейкоцит и, в конце концов, затянуть его внутрь раковой клетки, где он переварится. Кроме того, другие работы показали, что раковые клетки выделяют иммуносупресивные вещества, которые ослабляют функцию иммунной системы.

За последние 25 лет были сделаны многочисленные попытки укрепления иммунной системы с помощью различных модификаторов биологической реакции (МБР). Эти вещества, создаются из бактерий и грибков, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Кроме того, некоторые виды цитокинов работают подобно МБР, например, интерфероны, интерлейкин-2 и интерлейкин-12. Есть две проблемы, связанные с этими МБР: 1) токсичность, 2) развитие низкой реактивности, при которой однократное введение МБР может значительно повысить активность клеток NK, но повторное введение того же МБР приведет к депрессии активности NK-клеток. Интересно отметить, что BioBran имеет преимущества перед другими МБР. Он нетоксичен и не показал низкой реактивности за четыре года наблюдений. Настоящая работа была проведена с целью изучения влияния нового МБР, известного под названием BioBran, на функцию NK-клетки и пролиферацию Т-и В-клеток у 32 пациентов. У отдельных пациентов были зарегистрированы опухолевые антигены.

Пациенты

Настоящее исследование проводилось на 32 пациентах страдающих от раковых заболеваний. У пациентов были различные типы опухоли: простаты, молочной железы, множественная миелома и лейкемия. Большинство пациентов прошли через циторедукцию при помощи традиционных видов терапии, таких как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или химиотерапия.

Материалы

BioBran – это арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей, обработанный под воздействием ферментов из грибов шиитаке. Это полисахарид, который содержит гемицеллюлозу. Торговое название BioBraп – BioBran MGN-3 (компания Daiwa Pharmaceuticals, Co., Ltd., Токио, Япония).

Методы

Протокол лечения. Пациентами давали BioBran (3 г в день) ежедневно перорально.

Опухолевый специфический антиген (ОСА). ОСА для каждого типа опухоли измерялся до начала лечения препаратом BioBran и через месяц после лечения.

Линия опухолевых клеток. К562, клетки эритролейкемической линии человека, использовались в качестве целевой. Опухолевые клетки культивировались в полной среде, состоящей из RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотика (100 единиц пенициллина и 100 г\мл стрептомицина).

Препарат лимфоцитов периферической крови (ЛПК). ЛПК были приготовлены из свежей гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Клетки были два раза промыты сбалансированным солевым раствором Хенкса и ресуспендированы до концентрации 10 х 106 кл\мл в общей среде.

51CR – анализ для измерения активности NK-клеток. Активность нормальных киллеров измерялась стандартным 4-х часовым 51CR- анализом. Вкратце, 1х104 опухолевые целевые клетки, меченные Cr в 0.1 мл обшей среды добавлялись в различные лунки 96-луночного титрационного планшета. Затем клетки-эффекторы пипеткой переносились в ячейки в 4 копиях, чтобы получить соотношение клеток-эффекторов к целевым клеткам (E:T) 12:1, 25:1, 50:1 и 100:1. После 4 часового инкубационного периода при температуре37 °C, планшеты были центрифугированы (1 400 об\мин в течение 5 минут) и было собрано 0.1 мл центрифугата из каждой лунки и пересчитано по гамма-счетчику (Beckmann G50, Beckmann Instruments).

Процент освобождённых изотопов рассчитывался по следующей формуле:

Спонтанное освобождение из целевых клеток составило не боле 8-10% от общего освобождения. Общее освобождение измерялось прибавлением 0.1мл Тритона Х-100 (Sigma Chemical Co.) в назначенные лунки. Единицы лизиса рассчитывались из кривых титрования эффектора с одной определённой единицей лизиса, так как требовалось, чтобы количество клеток-эффекторов достигло 20% лизиса для К562.

Гранулярность естественных киллеров. Выделение лимфоцитов периферической крови в градиенте перколла было настроено на 2.5=10.6\мл и центрифугировано на слайдах при 1 000 об\мин в течение 5 минут при помощи цитоцентрифуги (Shanton Southern Institute, Сеуикли, Пенсильвания). Слайды были высушены в воздушной сушке, фиксированы метанолом, окрашены 5% раствором Гимзе в течение 10 минут. Окрашенные препараты были изучены на предмет гранулярности NK-клеток.

В естественных условиях пролиферация T-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Мы исследовали влияние в естественных условиях BioBran на пролиферацию Т-клеток и В-клеток при помощи тимидина. Мононуклеарные клетки были подготовлены из периферической крови пяти раковых пациентов до лечения BioBran и через месяц после лечения. Клетки были инкубированы при 2х105 кл\мл в общей среде. Клетки были обработаны фитогемагглютинином (10г\мл), конканавалином А или митогеном лаконоса в течение 3 дней. На последние 18 часов к культурам клетки был добавлен меченый тритием тимидин. Были собраны образцы ДНК и определено накопления тимидина при помощи сцинтиллоскопа. Все эксперименты проводились в трех повторениях, данные выражены, как число импульсов в минуту.

Статистический анализ. Т-критерий Стьюдента применялся для изучения значимости отклонений между активностью NK-клеток и реакцией Т- и В-клеток на митогены до и после лечения препаратом BioBran.

Результаты

1. Активность NK -клеток

Рисунок 1 показывает базовые значения цитотоксичных ответов NK-клеток у 32 пациентов, больных раком. У пациентов отмечался общий низкий уровень функции NK-клеток. Депрессия активности NK-клеток наблюдалась у пациентов с разными типами опухолей: простаты, 11.1 единиц лизиса; молочной железы 11.4 единиц лизиса; множественная миелома, 7.3 единиц лизиса; лейкемия 4.3 единиц лизиса. Исследования лимфоцитов периферической крови у 12 участников спустя 1-2 недели после первичного исследования, не выявили статистически значимых различий в активности NK-клеток по сравнению с первоначальными результатами. Лечение MGN-3 показало значительное повышение активности NK-клеток до десяти раз. Усиливающий эффект MGN-3 был выявлен при всех типах опухолей: простаты 41.9 единиц лизиса; молочная железа 33 единиц лизиса; множественная миелома 31.9 единиц лизиса; лейкемия 51.4 единиц лизиса.

Рисунок 1. Влияние BioBran на активность NK-клеток у 32 пациентов от одной до двух недель после лечения. Типы опухолей: простата (10), молочная железа (12), множественная миелома (5), лейкемия (5). Единицы лизиса при 20% *р < 0.001

2. Гранулярность NK -клеток.

Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови до лечения показала низкую гранулярность или ее отсутствие (рис.2а).

Рисунок 2(а) . Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови. NK-клетки были взяты от ракового пациента до начала лечения BioBran. Обратите внимание на ядерно-плазменное отношение и отсутствие гранул.

Рисунок 2(b ). Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови того же пациента через 1 неделю после лечения BioBran. Клетки демонстрируют высокое гранулярное содержание.

С другой стороны, лечение BioBran показало значительное повышение гранулярного содержания через 1 неделю после лечения (рис. 2b). Активированные BioBran NK-клетки показали повышение связывающей способности и способности уничтожать раковые клетки (рис. 3).

Рисунок 3. Препарат цитоцентрифугирования опухолевой клетки К562. NK-клетки были активированы BioBran. (а) Первый шаг процесса представлен связыванием NK-клетки к клеткой опухоли. (b) Одна опухолевая клетка мертва. (с) Обе опухолевые клетки мертвы, а NK-клетка все еще активна. (d) NK-клетка самостоятельно отделяется от мертвых опухолевых клеток.

3. Пролиферация в естественных условиях Т- и В-лимфоцитов

Рисунок 4 показывает, что лечение BioBran значительно повысило пролиферацию Т-клеткок, это показывает реакция на митогены: фитогемагглютинин и конканавалин А. Пролиферация В-клеток также повысилась после лечения BioBran, о чем свидетельствует реакция на митоген лаконоса, по сравнению с базовым значением.

PHA – фитогемагглютинин, Con A - конканавалин А, PWM - митоген лаконоса

Рисунок 4. Действие BioBran в ответ на митоген. Т- и В-клетки через месяц после лечения. Мононуклеарные клетки были культивированы из периферической крови в присутствии фитогемагглютинина, конканавалина А и митогена лаконоса. Данные представляют среднее значение (стандартное отклонение у пяти человек.) *р<0.001.

4. ОСА и активность естественных киллеров у отдельных пациентов

Пациентов проверили на предмет опухолевого специфического антигена: простата, простат специфический антиген (ПСА); множественная миелома, белок Бен-Джонса (ББД) или ICg. Рак молочной железы проверялся при помощи РЭА и КТ сканирования от одного до двух раз в год. Был проведен анализ различных типов злокачественных опухолей у отдельных пациентов.

Пациент К, 39 лет. Был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Была проведена химиотерапия, в результате которой число лейкоцитов составило 5.6, при норме от 4.5 до 10.5. Химиотерапия была прекращена и пациент начал принимать BioBran в январе 1995 года. Показатели лейкоцитов оставались в норме с того времени. Активность NK-клеток пациента составила 7.9 единиц лизиса и повысилась до 113 единиц лизиса через одну неделю после лечения BioBran. Уровень активности NK-клеток остается высоким уже в течение 4 лет.

Пациент Y, 52 года, менеджер магазина из Японии. Ему также был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Он отказался от традиционного лечение. Количество лейкоцитов 31 марта 1998 года составило 18 700\мл. Пациент начал принимать BioBran.и 30 апреля число лейкоцитов упало до 11 000. С того времени его состояние остается стабильным.

В 1994 году R обратился к нам по поводу рака простаты. Гормональная терапия привела к тому, что уровень ПСА был 0.1, но известно, что маркёр со временем снова повышается. Пациенту начали давать BioBran.и уровень ПСА остается в норме последние 4 года.

М, пациентка, у которой возник рецидив рака молочной железы в апреле 1995 года. До этого ей была проведена операция, за которой последовала химиотерапия. Она начала прием BioBran после завершения курса химиотерапии и с тех пор компьютерная томография показывала хорошие результаты. Больше не было признаков рецидива заболевания, согласно компьютерной томографии и биопсии. Активность NK-клеток пациентки составила 16.4 единицы лизиса. Это увеличенные в два раза показатели после одной недели лечения BioBran. Активность продолжала увеличиваться до 128 единиц лизиса и остается на высоком уровне в последние годы.

Обсуждение

BioBran считается сильным модификатором биологического ответа, о чем свидетельствует повышенная активность NK-клеток у животных и человека. Интраперитонеальная инъекция мышам BioBran показала повышение активности NK-клеток в несколько раз через два дня после лечения. Другие исследования на крысах, в которых BioBran применялся вместе с пищей, также показал повышение активности NK-клеток в зависимости от применяемой дозы. Исследования проводились и на здоровых участниках, которые принимали BioBran перорально. Повышение активности NK-клеток в 2-3 раза наблюдалось через неделю после лечения BioBran в дозе 30 и 45 мг\кг в день, а более низкие дозы 15 мг\кг в день показали повышение активности в два раза только через месяц.

По нашему мнению, особенный интерес представляет исследование стимулирующего влияния BioBran на активность NK-клеток у пациентов с наличием злокачественного новообразования. Пациенты прошли химиотерапию и лучевую терапию, так как требовалась циторедукция. Однако в результате этих воздействий активность естественных киллеров снижалась. Учитывая потребность организма в естественном иммунитете, мы поняли, что усиление активности NK-клеток может оказаться клинически крайне важным для уничтожения оставшихся раковых клеткок, которые не были уничтожены во время лучевой и химиотерапии. Возможно усилить активность NK-клеток за счет применения различных модификаторов биологического отклика. Однако токсичность и низкий иммунологический ответ ограничивают их применение. BioBran является безопасным продуктом, у пациентов не развивалась устойчивость к иммуному ответу на препарат во время 4 лет проведения исследования. За активностью NK-клеток велось наблюдение, чтобы можно было задокументировать все изменения в активности циркулирующих иммуноцитов во время терапии с данными препаратами. Было выявлено усиление активности NK-клеток благодаря BioBran уже через 1-2 недели после лечения, и эта активность удерживалась на высоком уровне при продолжении лечения BioBran.

Циторедукция, за которой следовала иммунотерапия BioBran применялась к 32 пациентам, больным раком. Кроме повышения активности NK-клеток, пациенты показали постепенное снижение уровня опухоль специфического онтигена без признаков увеличения в течение 4 лет, пока проводилось исследование.

Изучались механизмы, благодаря которым BioBran повышает активность NK-клеток. Согласно нашим исследованиям, два механизма отвечают за активность NK-клеток, вызванную BioBran. Во-первых, это происходит за счет гранулярности NK-клеток, во-вторых – за счет повышения производства цитокина. Что касается гранулярности, NK- клетки наших пациентов имели либо низкую гранулярность, либо ее полное отсутствие. Примечательно, что лечение BioBran значительно повышало гранулярное содержание NK-клеток (Рис. 2). Гранулы располагаются не только в порции цитоплазмы, но также и между ядерными и клеточными мембранами. Экзоцитоз гранул NK-клеток и секреция молекул, формирующих поры (перфорины), хранящиеся как цитоплазмические гранулы могут представлять один из важнейших механизмов для уничтожения клеток рака системой NK-клеток. Важная роль гранул при уничтожении опухолевых клеток NK-клетками была выявлена при наблюдении за изолированными и очищенными гранулами. Они обладают разлагающим воздействием на разные типы опухолевых клеток. Следовательно, мы полагаем, что повышенный уровень гранулярности NK-клеток является важным фактором для усиления клеточного ответа на гибель рака благодаря применению BioBran.

Что касается цитокинов, было выявлено, что сразу несколько цитокинов влияют на пролиферацию NK-клеток или на цитолитическую активность. Большему изучению подверглись интерфероны и ИЛ-2. Подавление активности NK-клеток у раковых пациентов была связана с недостаточным производством лимфокина. Предположительно, усиление цитотоксической функции NK-клеток за счет введения BioBran совпадает со значительным повышением уровней различных цитокинов. Грануляция больших гранулярных лимфоцитов может указывать на секреторную функцию. Пока не известно является ли производство различных лимфокинов полифункциональным свойством подгруппы больших зернистых лимфоцитов. Более вероятно, что различные подгруппы больших зернистых лимфоцитов ответственны за различные лимфокины. В лабораторных исследованиях было выявлено, что лечение BioBran значительно повышает производство ФНО-альфа и интерферонов. Кроме того, пациенты с различными типами злокачественных опухолей показали повышение уровней ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа после лечения BioBran.

Наша работа показала первичный эффект BioBran на NK-клетки. Однако есть данные, полученные от здоровых контрольных участников исследования, что другие иммуноциты, Т- и В-клетки показали усиление своих функций после лечения. В данном исследовании мы выявили, что у пациентов были усилены функции Т- и В-клеток, как доказательство реакции пролиферации на разные митогены. Это доказывает, что BioBran вызывает общую стимуляцию иммунитета.

Предварительные результаты настоящего исследования достаточны для проведения дальнейших клинических исследований.

Первым исследованием всегда является подсчет лейкоцитарной формулы (см. главу «Гематологические исследования»). Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови.

Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ). Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы ВОЗ рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).

Метод исследования

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.

Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.

Условия взятия и хранения образцов

Венозная кровь, взятая из локтевой вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.

Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.

Интерпретация результатов

Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.

Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.

В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.

NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.

Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.

Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.

Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.

Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.

Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).

Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.

Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.

Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.

ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.

Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.

Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.

Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.

Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.

Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.

Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.

Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.

Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.

Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.

Морфологически ЕК представляют собой большие гранулосодержащие лимфоциты. Характерные для них азурофильные цитоплазматические гранулы являются аналогами лизосом фагоцитирующих клеток. Однако ЕК фагоцитарной функцией не обладают. Неспеци­фический характер их цитотоксического действия отличает эти клет­ки от антигенспецифических Т-киллеров и от К-клеток, опосредую­щих антителозависимую цитотоксичность. Среди лей­коцитов крови человека ЕК составляют до15% (подробнее см.иммунокомпетентнык клетки).

Гуморальные факторы

Лизоцим

Лизоцим представляет собой термостабильный белок типа муколитического фермента. Он содержится в тканевых жидкостях животных и человека - в слезах, слюне, перитонеальной жидкости, плаз­ме и сыворотке крови, в лейкоцитах, материнском молоке и др.

Лизоцим продуцируется моноцитами крови и тканевыми мак­рофагами. Он вызывает лизис многих сапрофитных бактерий, оказы­вая менее выраженное литическое действие на ряд патогенных мик­роорганизмов и не активен в отношении вирусов.

Механизм бактериолитического действия лизоцима состоит в гид­ролизе связей в полисахаридных цепях пептидогликанового слоя клеточ­ной стенки бактерии. Это приводит к изменению ее проницаемости, сопровождающемуся диффузией клеточного содержимого в окружа­ющую среду, и гибели клеток.

Заживление ран в области слизистых оболочек, имеющих контакт с большим количеством различных микроорганизмов, в том числе и патогенных, в известной степени объясняется наличием лизоцима.

Система комплемента

Системой комплемента называют многокомпонентную само­собирающуюся систему белков сыворотки крови, которая играет важ­ную роль в поддержании гомеостаза. Она способна активироваться в процессе самосборки, т.е. последовательного присоединения к обра­зующемуся комплексу отдельных белков, которые называются компо­нентами, или фракциями комплемента. Таких фракций известно девять. Они продуцируются клетками печени, мононуклеарными фа­гоцитами и содержатся в сыворотке крови в неактивном состоянии.

Процесс активации комплемента может запускаться (иниции­роваться) двумя разными путями, получившими названия классический и альтернативный .

При активации комплемента классическим путем инициирующим фактором является комплекс антиген-антитело (им­мунный комплекс). Причем антитела только двух классов IgG и IgМ в составе иммунных комплексов могут инициировать активацию ком­племента.При присоединении С1 к ком­плексу антиген-антитело образуется фермент (С1-эстераза), под дей­ствием которого формируется энзиматически активный комплекс (С4b, С2а), называемый СЗ-конвертазой. Данный фермент расщепляет СЗ на СЗа и СЗb. При взаимодействии субфракции СЗb с С4 и С2 обра­зуется пептидаза, действующая на С5. Если инициирующий иммун­ный комплекс связан с клеточной мембраной, то самособирающийся комплекс С1, С4, С2, СЗ обеспечивает фиксацию на ней активиро­ванной фракции С5, а затем С6 и С7. Последние три компонента совместно способствуют фиксации С8 и С9. При этом два набора фракций комплемента - С5а, С6, С7, С8 и С9 - составляют мемб-раноатакующии комплекс, после присоединения которого к клеточной мембране клетка лизируется из-за необратимых повреждений струк­туры ее мембраны

Таким образом, при активации комплемента классическим путем ключевыми компонентами являются С1 и СЗ, продукт расщепления которого СЗb активирует терминальные компоненты мембраноатакующего комплекса (С5-С9).

Особенность альтернативного пути активации комплемента (ключевым компонентом является СЗ,) состоит в том, что инициация может происходить без участия комплекса антиген-антитело за счет полиса­харидов и липополисахаридов бактериального происхождения - липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных бакте­рий, поверхностных структур вирусов, иммунных комплексов, вклю­чающих IgА и IgЕ.

В альтернативном пути активации комплемента необходимо уча­стие сывороточного белка, названного пропердином, который акти­вен лишь в присутствии ионов М§ 2+.

Как видно из описанных каскадов реакций, многие компоненты комплемента при активации проявляют активность протеиназ или эстераз, работающих только внутри системы. При этом в процессе активации комплемента появляются продукты протеолиза компонен­тов С4, С2, СЗ и С5. Одни из них (фрагменты С4b, С2b, СЗb, С5b) участвуют непосредственно в самосборке и активации самой систе­мы комплемента. В отличие от них низкомолекулярные фрагменты СЗа и С5а, названные анафилатоксинами, по совокупности биологи­ческих эффектов -освобождение гистамина из тучных клеток, хе­мотаксис фагоцитов, нарушение проницаемости сосудов, сокращение гладких мышц и др. -играют существенную роль в патогенезе бо­лезней иммунных комплексов и других заболеваний, при которых резко усиливаются связывание и активация комплемента в организме.

Фракции комплемента при их активации классическим или аль­тернативным путем выполняют ряд эффекторных функций:

- мембраноатакующий комплекс опосредует цитолитическое и цитотоксическое действие специфических антител на клетки-«мишени»;

- анафилотоксины участвуют в иммунопатологических реакциях;

- компоненты комплемента изменяют физико-химические свой­ства иммунных комплексов; уменьшают степень агрегации и эффек­тивность их фагоцитоза;

- фрагмент СЗb способствует связыванию и захвату иммунных комплексов фагоцитами, опсонизируя объекты фагоцитоза;

- фрагмен­ты СЗb, С5а , обладающие свойствами хемоаттрактантов, уча­ствуют в развитии воспаления.

Белки острой фазы

В ходе развития защитных воспалительных реакций после инфицирования или повреждения, а также при онкогенезе и беремен­ности в организме начинается усиленная продукция белков острой фазы. Так назвали большую группу белков, обладающих антимикроб­ным действием, способствующих фагоцитозу, активации комплемента, формированию и ликвидации воспалительного очага. Белки ост­рой фазы продуцируются в печени при действии цитокинов, в основ­ном ИЛ-1, ФНО-а и ИЛ-6. Основную массу белков острой фазы составляют С-реактивный белок и сывороточные амилоиды А и Р. Другие группы белков острой фазы составляют факторы свертыва­ния крови, металлосвязывающие белки, ингибиторы протеаз, компо­ненты комплемента и некоторые другие. При воспалении содержание в крови большинства белков многократно возрастает, и определение С-реактивного белка входит в число общепринятых методов диагно­стики воспалительных процессов.

С-реактивный белок получил название вследствие способности присоединять и преципитировать С-полисахарид. Далее было установлено, что С-реактивный белок (СРБ) присоединя­ется к фосфатидилхолину - компоненту клеточной мембраны лю­бых клеток. Он способен присоединяться к микроорганизмам, акти­вированным лимфоцитам, поврежденным клеткам разных тканей, активируя при этом комплемент. Присоединяясь к нейтрофильным фа­гоцитам, СРБ усиливает фагоцитоз и элиминацию объектов фагоци­тоза. Вместе с этим СРБ подавляет продукцию супероксида и осво­бождение из гранул фагоцитов ферментов, защищая тем самым ткани от повреждения.

Сывороточный амилоид Р близок по структуре к СРБ, обладает способностью к активации комплемента.

Сывороточный амилоид А - липопротеин, обладающий способ­ностью к хематтракции нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. По­вышенный уровень этого белка в крови наблюдается при туберкулезе и ревматоидном артрите.

К факторам свертывания крови относятся фибриноген и фактор фон Виллебранда, способствующие образованию сгустков в сосудах зоны воспаления.

Другую группу белков острой фазы составляют белки, связываю­щие железо - гаптоглобин, гемопексин, трансферрин - и тем са­мым препятствующие размножению микроорганизмов, нуждающих­ся в этом элементе.

Уровень ингибиторов протеаз в крови возрастает при воспалении в 2-3 раза. Антитрипсин, антихимотрипсин и макроглобулин препят­ствуют разрушению тканей протеазами нейтрофилов в очагах воспа­ления.

Цитокины

Медиаторы межклеточных взаимодействий, именуемые цитокинами , определяют как реакции врожденного и приобретенного иммунитета, так и ряд других жизненно необходимых функций орга­низма, значение которых выходит за рамки иммунологии.

Цитокинами называют гормоноподобные медиаторы , продуци­руемые разными клетками организма и способные повлиять на функции других или этих же групп клеток. Цитокины - пептиды или гликопротеиды, действующие как аутокринные, паракринные или межсистемные сигналы. Цитокины формируются как активи­рованными или поврежденными клетками, так и клетками без до­полнительной стимуляции. Регуляторами продукции цитокинов мо­гут быть другие цитокины, гормоны, простагландины, антигены и многие другие агенты, воздействующие на клетку. Некоторые зако­номерности цитокиновой регуляции могут быть сформулированы следующим образом:

· Каждая клетка продуцирует разные цитокины.

· Каждый цитокин может быть продуктом разных видов клеток.

· Один цитокин обладает разными эффектами действия.

· Цитокин может стимулировать или подавлять активность клетки-«мишени».

· Каждая клетка имеет рецепторы к разным цитокинам и, следо­вательно, может подвергаться одновременному или разновременному воздействию нескольких цитокинов.

· Взаимодействие нескольких цитокинов на клетку может быть синергичным или антагонистичным.

· Рецепторы цитокинов могут отделяться от клетки и взаимодей­ствовать с цитокинами вне клетки. В этих условиях свободные ре­цепторы связывают соответствующие цитокины, что препятствует их контакту с клеточными рецепторами.

· Цитокины, их рецепторы на клетках и во внеклеточных средах составляют сложную функциональную сеть, результат действия кото­рой зависит от взаимодействия этих факторов между собой и други­ми цитокинами.

· Цитокины действуют в низких концентрациях порядка 0,001 мкг/мл. Для воздействия на клетку достаточно, чтобы цитокин свя­зался с 10% клеточных рецепторов к нему.

Цитокины составляют обширный класс медиаторов различного происхождения, обладающих разными свойствами. Их классифика­ция носит условный характер, так как многие их них обладают одно­временно несколькими свойствами и могут быть отнесены к разным группам. Цитокины объединены в группы в зависимости от их про­исхождения (лимфокины, монокины), от характера эффекта (провос-палительные, противовоспалительные). Цитокины, регулирующие вза­имодействия лейкоцитов между собой и другими клетками, называ­ют интерлейкинами (ИЛ). Большинство цитокинов именуется по действию, которое было впервые обнаружено.

Группа интерлейкинов включает 17 цитокинов, большинство из которых играет ключевую роль в развитии специфического иммунно­го ответа.

Продуцируемый макрофагами и моноцитами ИЛ-1 обуславливает проли­ферацию лимфоцитов при индукции иммунного ответа, а также активирует Т-лимфоциты, увеличивает продукцию антител. ИЛ-1 действует на нейтрофилы, способствуя хемотаксису, активации метаболизма, выходу из клеток лизоцима и лактоферрина. Этот цитокин - эндогенный пироген, вызывающий лихорадку за счет воздействия на гипоталамический центр терморегуляции.

ИЛ-2 продуцируется Т-лимфоцитами (в основном Тх1), активированны­ми антигеном, собственным ИЛ-2, другими интерлейкинами: ИЛ-1, ИЛ-6, интерфероном, фактором некроза опухоли (ФНО). Без ИЛ-2 позитивный им­мунный ответ на антиген не возникает, стимулированный антигеном лимфо­цит гибнет, что может привести к развитию толерантности к данному анти­гену. Интерлейкины ИЛ-4 и ИЛ-10 подавляют продукцию ИЛ-2. Это способ­ствует развитию эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), формированию киллеров из СD8 + лимфоцитов, усилению действия ЕК. Все это стимулирует противоопухолевый иммунитет и позволяет рекомендовать рекомбинантный ИЛ-2 для лечения онкологических больных.

Факторы роста - большая группа гликопротеинов, контролиру­ющих пролиферацию и созревание потомков стволовой кроветвор­ной клетки. Они продуцируются разными видами клеток и действу­ют на разные этапы их развития.

Колониестимулирующие факторы (КСФ) получили свое название благодаря тому, что было обнаружено их свойство способствовать дифференцировке введенных мышам клеток костного мозга в зрелые гранулоциты и/или моноциты с образованием в селезенке животных ко­лоний соответствующих клеток. Гранулоцитарный КСФ обеспечивает дифференцировку предшественников гранулоцитов в зрелые нейтрофи-лы. Моноцитарный КСФ способствует созреванию моноцитов и мак­рофагов из клеток-предшественников, а гранулоцитарно-моноцитарный КСФ стимулирует формирование гранулоцитов и макрофагов из их общих предшественников.

Интерфероны (ИФ) были открыты как противовирусные аген­ты. Затем были обнаружены их иммунорегулирующие свойства. Су­ществует три разновидности ИФ

У здоровых людей ИФ в крови не обнаруживаются. Их уровень повышен при красной волчанке, ревматоидном артрите, склеродер­мии. Наличие интерферона в крови этих больных увеличивает рези­стентность к вирусным инфекциям и опухолям, но неблагоприятно сказывается на развитии аутоиммунных процессов, свойственных этим заболеваниям.

Препараты интерферонов используются для лечения лейкемий и некоторых других онкологических процессов. Для усиления противо­вирусной защиты используют средства, повышающие продукцию собственного интерферона (интерфероногены). В качестве индукто­ров эндогенного интерферона применяют противовирусные вакцины, препараты РНК и ДНК.

Цитотоксины. Такое название получили цитокины группы фак­торов некроза опухолей (ФНО) , который был впервые обнаружен как компонент сыворотки крови животных, стимулированных бактерий­ным токсином, вызывающий некротические процессы в опухолевой ткани. ФНО служит медиатором ответа организма на микробную инвазию. Эндотоксины (липиполисахариды) микробов стимулируют клетки-продуценты к образованию ФНО, который, в свою очередь, обеспечивает хемотаксис фагоцитов в инфицированную ткань и уси­ливает фагоцитоз возбудителей. В настоящее время известно, что ФНО составляют по крайней мере две группы (альфа и бета) медиаторов, продуцируемых активированными макрофагами, естественными кил­лерами, а также лимфоцитами, нейтрофилами и тучными клетками.

Завершая рассмотрение цитокинов и их эффектов, необходимо подчеркнуть, что в механизмах иммунитета участвуют две группы противоположно действующих цитокинов. Одна группа - провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и другие лимфокины, ФНО-а, а также ИФ), стимулируя разные клетки и механизмы, усиливают врожденную неспецифическую защиту, воспаление, способствуют развитию специфических иммунных реакций. Вторая функциональная группа - противовоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ТРФ) подавляет развитие как неспецифических, так и специфических иммунных реакций.

Адгезины. Среди факторов, определяющих прямые контакты клеток орга­низма между собой и с представителями микрофлоры, существенную роль играют молекулы адгезии или адгезины. Предполагается, что в эволюции живого появление молекул адгезии сделало возможным возникновение мно­гоклеточных организмов. Более 90% микробов, составляющих нормальную микрофлору человеческого организма, обитают в нем благодаря молекулам адгезии. Блокирование адгезии патогенных микроорганизмов к клеткам и тканям организма - один из основных путей антимикробной защиты. Моле­кулы адгезии экспрессируются на мембранах клеток, определяя их способ­ность контактировать с другими клетками и неклеточными субстратами. Ре­цепторами молекул адгезии в организме могут быть другие молекулы адгезии на поверхности клеток, углеводные компоненты мембран, иммуноглобулины. Количество молекул адгезии и рецепторов к ним увеличивается при антиген­ной или любой другой активации клеток.

В ходе иммунного ответа молекулы адгезии определяют контакты антиген-представляющих клеток с лимфоцитами и лимфоцитов между собой. Молеку­лы адгезии входят в состав рецепторов иммунокомпетентных клеток и опреде­ляют тропность клеток иммунной системы к определенным тканям или орга­нам - хоминг-эффект (англ. Ноте - дом).

Молекулы адгезии условно разделяют на группы: селектины, интегрины, молекулы суперсемейства иммуноглобулинов .

Селектины - семейство поверхностных молекул адгезии, определяю­щие присоединение клеток к углеводным компонентам других структур.

Интегрины - большая группа молекул, определяющая взаимодействия белок-белок.Интегрины играют роль в межклеточных контактах при воспалении, реакциях иммуните­та, аутоиммунных повреждениях тканей, процессах репарации. Интегрины экспрессируются на клетках опухолей и играют роль в процессах метастази-рования. Их определение используется для диагностики разных видов злока­чественных опухолей.

К молекулам суперсемейства иммуноглобулинов относится более 15 ва­риантов молекул, которые обозначаются заглавными латинскими буквами, соответствующими обозначению их функции: адгезии клетка-клетка или бе­лок-белок.

К молеку­лам адгезии суперсемейства иммуноглобулинов относятся СD4 + , СD8 + моле­кулы Т-лимфоцитов, определяющие их контакты со структурами МНС II или I класса и дифференцировку этих двух классов Т-клеток между собой.

Адгезины формально не относятся к системе цитокинов, но обладают мно­гими сходными с ними функциями и участвуют в межклеточной кооперации.

Белки теплового шока

При воздействии на микробные и эукариотические клетки неблагоприятных стрессовых факторов - повышенной температуры, голодания, токсинов, тяжелых металлов, вирусов, в них формируют­ся защитные белки. Они получили название белков теплового шока , так как они были впервые обнаружены при тепловом воздействии на клетки.В результате повышаются термоустойчивость и резистентность клеток за счет за­щиты и коррекции поврежденных стрессом клеточных белков

Помимо поддержания резистент­ности клеток к шоковым воздействиям БТШ принимают участие в эндоцитозе вирусных частиц, процессинге антигенов, входят в состав некоторых рецепторных комплексов (стероидные рецепторы).

Естественные, или нормальные, киллеры (NK-клетки - аббр. от англ. Natural Killer )

изначально были описаны как большие гра­нулярные лимфоциты, способные распознать в организме некоторые виды раковотранс-формированных клеткок и уничтожить их без предварительной подготовки. Этот факт обус­ловил название клеток. Рецепторный аппарат и механизм действия естественных киллеров (ЕК) долгое время оставались неясными.

Сейчас установлено, что ЕК имеют морфоло­гию малых лимфоцитов, на их долю приходится около 15 % всех лимфоцитов. Они происходят из общей лимфоидной клетки-предшественницы, мигрируют с кровотоком, но отсутствуют в лимфе. Обнаруживаются в печени, селезенке, слизистых, матке. По маркерам, местам типичной локализа­ции и эффекторным механизмам выделяют две субпопуляции ЕК - «кровяную» и «тканевую».

Рецептор к МНС I класса анализирует плот­ность экспрессии этого маркера на мембране клетки. Дефицит этих молекул, наблюдаю­щийся при раковой трансформации клеток, также потенцирует цитотоксичность ЕК.

« Тканевые» ЕК ведут более оседлый образ жизни и обнаруживаются в большом количестве в пече­ни и децидаульной оболочке беременной матки. Несут маркер CD^CDSe"" 0 ™ и много Еэв-лиганда. Реализуемый эффекгорный механизм - антитело-независимая клеточно-опосредованная цитоток-

сичность (см. разд. 11.3.2). Клетками-мишенями являются лимфоциты, активированные пищевы­ми антигенами или аллоантигенами плода.

Помимо цитотоксических функций, ЕК вырабатывают цитокины (ИЛ-5, -8, у-ИФН, ФНО, гранулоцит-моноцит-колониестимули-рующий фактор - ГМ-КСФ и др.), активи­рующие макрофагально-фагоцитарное звено, развитие иммунного ответа и иммунного воспа­ления. Эффекторная функция ЕК усиливается цитокинами (ИЛ-2, -4, -10, -12, у-ИФН и др.).

ΓδТ-лимфоциты

Среди Т-лимфоцитов существует малочис­ленная популяция клеток с фенотипом, пре­имущественно CD4CD8, которые несут на своей поверхности особый TCR уб-типа. Это удТ-лимфоциты. Они практически полностью локализуются в эпидермисе и слизистой же­лудочно-кишечного тракта. Их общая числен­ность невелика - менее 1 % от общего пула Т-лимфоцитов, однако в покровных тканях может достигать 10 %.

Антигенный рецептор убТ-лимфоцита схо­ден с BCR, его активный центр непосредс­твенно связывается с эпитопом антигена. В отличие от а(3-типа, ySTCR не требует для рецепции процессинга антигена, а также его презентации в комплексе с молекулами МНС. Антигенные детерминанты могут быть пред­ставлены, например, молекулами CD1.

Иммунорецептор у8Т-лимфоцита обладает узким «репертуаром» специфичности. Клетки ориентированы на распознавание некоторых широко распространенных микробных ан­тигенов (липопротеинов, белков теплового шока, бактериальных суперантигенов и др.). Клетки принимают участие в удалении патоге­нов на ранних этапах противоинфекционной защиты.

у8Т-лимфоциты могут быть как эффекторны-ми, цитотоксическими клетками, так и регуля­торами иммунореактивности. Они синтезируют цитокины, активирующие местный иммунитет и локальную воспалительную реакцию, в том числе усиливают образование Т2-хелперов. Кроме того, Тб-клетки продуцируют ИЛ-7 и контролируют тем самым численность собственной популяции.

Установлено, что убТ -лимфоциты проис­ходят из автономного ростка в покровных

тканях, образованного стволовыми клетка­ми, мигрировавшими туда на ранних эта­пах эмбриогенеза. В созревании минуют ти­мус. Активируются клетками поврежденного эпителия ЖКТ и эпидермиса. Размножение уб-клеток усиливается под действием ИЛ-7.